[eng] The goal of this project is to generate a safe harbor site in the genome of human
cells, where information could be specifically inserted without the action of
nucleases. The mechanism that we present here is based on two different sitespecific
recombinases phiC31 and Bxb1, as well as on the piggyBack and Sleeping
Beauty transposons. Recombinase phiC31 is an integrase used by phages to establish
the lysogenic life cycle. During integration, phiC31 drives recombination between the
attP and the attB attachment sites on the phage and host genome, respectively. In
naturally occurring phage infestations, the end result is an integrated phage genome
flanked by new attL and attR sites, generated by recombination of the original, attP
and attB sites. In our system, the phage genome is substituted by the acceptor sites
that will constitute the core of the safe harbor locus. Under inducing conditions, the
phage genome is excised via integrase-mediated recombination between attL and
attR regenerating the attP and attB attachment sites. This action is directed by
PhiC31 in the presence of an accessory protein (the recombination directionality
factor, RDF). The alternative use of phiC31, alone or together with RDF, allows for the
indefinite repetition of the cycle and the subsequent incorporation into the targeted
locus of as many attachment sites as needed. The whole mechanism is made possible
by the coordinated and alternative use of piggyBac and Sleeping Beauty transposons
that, at each step, remove residual DNA fragments (plasmid sequences, selection
elements, etc.). Once the final configuration of the safe harbor locus is reached, the
Bxb1 recombinase is used to upload the desired genetic information: markers,
therapeutic genes, inducible system or even complete regulatory routes.
[spa] El objetivo principal de este proyecto es generar una plataforma de carga segura
dentro del genoma de células humanas, donde la información pueda ser insertada de
forma específica sin la necesidad de usar nucleasas. De este modo se reduciría la
posibilidad de integraciones azarosas y se aumentaría la eficiencia de integración.
Para este fin, el mecanismo propuesto en la presente Tesis Doctoral combina el uso
de dos recombinasas diferentes, phiC31 y Bxb1, así como de los sistemas de
transposición piggyBac y Sleeping Beauty. La recombinasa phiC31 es una integrasa
encargada de la incorporación del ADN de fagos en el hospedador durante el ciclo
lisogénico. La integración se realiza mediante recombinación entre dos sitios de
unión específicos, attP presente en el fago y attB localizado en el genoma del
hospedador. Durante el proceso de infección el genoma del fago queda integrado en
el genoma del hospedador y flanqueado por dos nuevos sitios de reconocimiento
específico, attL y attR, generados a partir de la recombinación de las secuencias
originales, attP y attB. En nuestro sistema, el genoma del fago es sustituido por los
sitios de carga que constituirán el núcleo de la plataforma de integración. Bajo
condiciones de inducción el genoma del fago puede eliminarse del sitio de
integración mediante recombinación entre los sitios attL y attR, regenerándose en el
proceso los sitios attB y attP originales. Esta reacción inversa la cataliza phiC31 en
presencia de una proteína accesoria denominada Factor de Direccionalidad de la
Recombinación (RDF, por sus siglas en inglés). El uso alternativo de phiC31 sola o en
combinación con RDF, hace posible la repetición indefinida del ciclo de carga y la
consiguiente incorporación al locus genómico elegido de tantos sitios de
recombinación como se consideren necesarios. El ensamblaje completo de la
plataforma se consigue mediante el uso coordinado y alternativo de los transposones
piggyBac y Sleeping Beauty que permite en cada paso la eliminación de los
fragmentos de ADN no deseados (secuencias del plásmido, elementos de selección,
etc.). Una vez constituida la plataforma de carga, la recombinasa Bxb1 es la
responsable de mediar la carga de la información genética deseada: marcadores,
genes terapéuticos, sistema inducible o incluso rutas regulatorias completas.
[cat] L’objectiu principal d’aquest projecte és generar una plataforma de càrrega segura
dins el genoma, en cèl·lules humanes, on la informació pugui ser inserida de manera
específica i sense necessitat d’usar nucleases. D’aquesta manera es reduiria la
possibilitat d’integracions degudes a l’atzar i s’augmentaria l’eficiència d’integració.
Amb aquest finalitat, el mecanisme proposat en la present Tesi doctoral combina l’ús
de dues recombinases diferents, phiC31 i Bxb1, així com dels transposons piggyBac i
Sleeping Beauty. La recombinasa phiC31 és una integrasa encarregada de la
incorporació de l’ADN de fags a l’hoste durant el cicle lisogènic. Aquesta integració es
realitza mitjançant la recombinació entre dos llocs d’unió específics, attP present en
el fag i attB localitzat en el genoma de l’hoste. Durant el procés d’infecció el genoma
del fag queda integrat en el genoma de l’hoste i flanquejat per dos llocs de
reconeixement específic nous, attL i attR, generats a partir de la recombinació de les
seqüències originals, attP i attB. En el nostre sistema, el genoma del fag és substituït
pels llocs de càrrega que constituiran el nucli de la plataforma d'integració. Sota
condicions d'inducció el genoma del fag pot eliminar del lloc d'integració mitjançant
recombinació entre els llocs attL i attr, regenerant-se en el procés els llocs attB i attP
originals. Aquesta reacció inversa la catalitza phiC31 en presència d'una proteïna
accessòria anomenada Factor de Direccionalitat de la Recombinació (RDF, per les
sigles en anglès). L'ús alternatiu de phiC31 sola o en combinació amb RDF, fa possible
la repetició indefinida del cicle de càrrega i la consegüent incorporació al locus
genòmic triat de tants llocs de recombinació com es considerin necessaris.
L'acoblament complet de la plataforma s'aconsegueix mitjançant l'ús coordinat i
alternatiu dels transposons piggyBac i Sleeping Beauty que permet a cada pas
l'eliminació dels fragments d'ADN no desitjats (seqüències del plàsmid, elements de
selecció, etc.). Un cop constituïda la plataforma de càrrega, la recombinasa Bxb1 és
emprada per a la càrrega d'informació genètica desitjada: marcadors, gens
terapèutics, sistemes induïble o inclús rutes reguladores completes.